冷凍干燥機(jī)的應(yīng)用之微生物細(xì)菌的儲(chǔ)存方法

好氧菌冷凍干燥管的制備

1、安瓿管準(zhǔn)備

安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時(shí)，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標(biāo)簽，標(biāo)上菌號(hào)及時(shí)間，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。

2、保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備

保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護(hù)劑時(shí)，應(yīng)注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100℃間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。

3、凍干樣品的準(zhǔn)備

在適宜的培養(yǎng)條件下將細(xì)胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期，進(jìn)行純度檢查后（參見科技部自然科技資源平臺(tái)聯(lián)合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測(cè)技術(shù)規(guī)程》（試行）），與保護(hù)劑混合均勻，分裝。微生物培養(yǎng)物濃度以細(xì)胞或孢子不少于108-1010個(gè)/ml為宜（以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個(gè)活細(xì)胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支）。采用較長(zhǎng)的毛細(xì)滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個(gè)球部。若是液體培養(yǎng)的微生物，應(yīng)離心去除培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)物與保護(hù)劑混勻，再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時(shí)間盡量要短，**在1-2小時(shí)內(nèi)分裝完畢并預(yù)凍。分裝時(shí)應(yīng)注意在無(wú)菌條件下操作。

4、預(yù)凍

一般預(yù)凍2小時(shí)以上，溫度達(dá)到-20℃到-35℃左右。

5、冷凍干燥

采用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機(jī)的干燥箱內(nèi)，開始冷凍干燥，時(shí)間一般為8-20小時(shí)。

6、真空封口及真空檢驗(yàn)

將安瓿管頸部用強(qiáng)火焰拉細(xì)，然后采用真空泵抽真空，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測(cè)定儀測(cè)定真空度。

7、保藏

安瓿管應(yīng)低溫避光保藏。

8、質(zhì)量檢查

冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢查，如存活率、生產(chǎn)能力、形態(tài)變異、雜菌污染等。

厭氧菌冷凍干燥管的制備

主要程序與需氧菌操作相同，注意保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備，保護(hù)劑使用前應(yīng)在100℃的沸水中煮沸15分鐘左右，脫氣后放入冷水中急冷，除掉保護(hù)劑中的溶解氧。

復(fù)蘇方法

先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，將安瓿管頂部燒熱，用無(wú)菌棉簽沾冷水，在頂部擦一圈，頂部出現(xiàn)裂紋，用挫刀或鑷子頸部輕叩一下，敲下已開裂的安瓿管的頂端，用無(wú)菌水或培養(yǎng)液溶解菌塊，使用無(wú)菌吸管移入新鮮培養(yǎng)基上，進(jìn)行適溫培養(yǎng)。